PCR(polymerase chain reaction)

★PCR(polymerase chain reaction)

PCR(polymerase chain reaction)은 시험관 내에서 DNA를 복제하는 효소로 하여금 연쇄 반응을 일으키게 하여 20cycle 반응 만에 한 개의 DNA helix를 백만 배로 증폭시켜 주는 획기적인 실험 기법이다. PCR의 원리는 극히 단순하고, 쉽게 응용할 수 있기 때문에 순수 분자생물학 분야 이외에도 의학, 이학, 농학, 수의학, 시품과학, 환경과학 뿐만 아니라 고고학이나 인류학에 이르는 분야까지 그 활용범위를 넓혀하고 있다. PCR덕택에 우리는 cloning을 하지 않고도 유전자를 물리화학적으로 분석하고 sequencing도 할 수 있게 되었다. 이 실험 기법은 1980년대 중반 미국 Cetus사의 Mulis 박사가 개발하였는데, 처음에는  E.coli의 DNA Polymerase를 매 cycle 마다 heat denaturation 후 새로 첨가해 주어야 했다. 그러나 높은 온도에서 자라는 미생물인 Thermus aquaticus(Taq) polymerase가 94℃에서도 활성이 상당히 유지된다는 사실의 발견과 함께 그 효소의 정제가 가능해짐에 따라 이 효소를 이용하여 PCR실험을 간편히 할 수 있게 되었다. PCR의 증폭효율에 영향을 미치는 요인으로는 ①각 단계의 반응온도와 시간 ②cycle 수 ③반응액 조성(주형 DNA, dNTP농도, Mg2+ 등..) ④primer 설계 ⑤사용하는 DNA polymerase  등이 있다. 또한 몇 가지 반응첨가물(DMSO, 비이온계면활성제, 글리세롤) 등에 따라 반응촉진효과가 나타나는 경우가 있다.

<PCR의 반응단계>

다음 과정이 계속 반복하여 진행되면서(보통 25∼35회) 원하는 DNA 부분을 증폭시키는 것이 PCR 의 원리이다. 쉽게 설명하면 튜브에 재료를 집어넣고 뜨겁게 덥혔다 식혔다 하면(기계가 온도변화를 제공함) Taq polymerase가 알아서 유전자를 합성해주는 것이다.

 1. DNA의 변성(denaturation)

 90°C - 96°C로 가열하여 double strand DNA(ds DNA)를 single strand DNA(ssDNA)로 분리시킨다. 높은 온도일수록 ssDNA 로 잘 이행되지만 Taq DNA polymerase도 온도가 아주 높은 상태에서는 활성이 낮아질 수 있으므로 보통 94°C로 한다. 첫 cycle에서는 확실한 변성을 위하여 약 5분정도 지속시킨다.

 2. Primer 의 결합(annealing)

 열처리로 한 가닥으로 변성한 DNA와 primer를 공존시킨 후 온도를 낮추면 2종류의 primer는 각각 상보적인 한 가닥 주형 DNA에 annealing한다. Annealing에 가장 적합한 온도와 시간은 primer의 염기배열과 그 길이에 따라 결정되지만 일반적으로 50°C - 65°C에서 30sec-1min정도로 진행된다. 염기간의 결합은 G와 C는 세 군데에서 수소결합이 일어나고, A와 T는 두 군데에서 결합이 일어나므로 G+C 비율에 따라 결합온도에 변화를 주는 것이 좋다. 사실 primer를 만드는 것도 이 annealing temperature를 고려하여 합성해야 한다. 일반적으로 GC content 가 50%가 되는 primer 쌍을 이용하는 것이 바람직한데, 만약 Annealing 온도를 높이면 primer-주형 DNA의 mismatch가 감소되어 반응 특이성이 높아진다. 그러므로 PCR이 되지 않았거나 혼합 primer 또는 mismatch 염기서열의 primer를 사용하는 경우는 37-45℃로 Annealing 온도를 낮출 필요가 있다. 일반적으로 Annealing Temperature(Tm)은 다음의 식으로 결정한다. Tm=4(G+C)+2(A+T)℃ 여기서 G+C의 계수가 더 큰 이유는 그들이 A+T의 수소결합보다 센 수소결합(A,T는 이중 수소결합/ G,C는 3중 수소결합)을 하기 때문이다. 일반적으로 annealiing Temperature는 Tm-3℃에서 결정한다.

 3. DNA의 합성(polymerization) or 신장반응(Extension)

 4종류의 기질(dNTP)이 공존하는 상태에서, DNA polymerase를 작동시켜 primer를 신장시킨다. Extension에 필요한 시간은 주형 DNA의 농도, 증폭단편의 크기, 반응온도에 따라 좌우되지만 일반적으로 Thermus aquaticus(Taq) polymerase를 사용할 경우 70°C - 74°C에서 30sec-10min(증폭크기 약 10kbp)정도시행하며, 원하는 PCR 산물의 크기가 크거나 반응요소의 농도가 낮을 때에는 시간을 연장시킬 수도 있다. Taq DNA polymerase는 보통 1분에 2,000-4,000 nucleotides를 합성할 수 있으므로 원하는 PCR 산물의 크기 1 kb마다 1분 정도의 시간을 배당하면 충분히 반응이 일어난다. 마지막 cycle 에는 약 10분 정도 시간을 충분히 주는 것이 좋다.

 4. Cycle 수

 PCR의 경우 n회의 cycle로 합성되는 DNA 사슬을 주형의 2n배가 되지만 실제로는 이보다 낮다. 효율이 저하되는 이유는 ①DNA polymerase의 활성의 감소 및 증폭단편(주형 DNA)의 증가로 인한 효소분자/주형비의 부족 ②증폭단편간 annealing이 primer의 annealing과 competition 등이 있다. 일반적으로 25-35cycles의 반응이 이루어지지만 증폭산물이 증가되면 그 자신이 primer가 되어 2차적인 반응이 일어나기 쉽고 비특이적인 DNA의 증폭을 일으키게 된다. 따라서 반응 cycle 수를 불필요하게 증가시키는 것은 바람직하지 않다. 그러나 주형 DNA량이 미량일 경우와 발현되는 mRNA의 양이 적어 해당 유전자의 cDNA의 양이 적은 경우 일반적인 경우보다 더 cycle 수를 늘려 DNA증폭양을 최대로 할 수 있다.

 

 

 

# PCR에는 다음과 같은 재료가 필요하다.

 

1. Template DNA : 증폭 대상이 되는 DNA. 일반적인 PCR의 경우 DNA를 사용하고, PCR 이전단계에서 Reverse Transcription을 행했을 경우 Reverse Transcription이 끝난 cDNA를 사용한다.

 

2. 한 쌍의 primer : Template DNA 가운데 선택적으로 증폭시키고자 하는 target DNA의 일부분에 상보적인 약 20bp 내외의 짧은 oligonucleotide. template DNA 가운데 원하고자 하는 부분의 염기성열에 정확히 상보적이기 위해서 primer의 염기서열 제작 시 여러 가지를 고려해야 한다.

 

 

 

< Primer제작시 고려사항 >

 

① 주형 DNA의 염기서열에 대해서 Primer의 결합위치 결정-ORF(Open Reading Frame: 발현된 mRNA 중에서 실제로 단백질로 발현이 되는 부분)내에서

② 증폭하려는 부위의 크기를 고려

ORF 전체가 목표인 경우는 Primer는 ATG시작코돈과 종결코돈을 포함하든지 그 밖의 서열에서 결정되어야 하며 크기가 그냥 정해지지만, ORF의 일부만 detection하여 유전자의 발현 정도만 비교할 목적이라면 대개 200 - 400 bp(가장 안정적으로 PCR이 되는 크기) 정도를 PCR하는 것이 좋다.

③ GC content와 primer length

관심 있는 부위와 길이가 결정되었다면 염기서열을 살펴가면서 primer를 선정하는데, 이 때 중요한 것은 G와 C의 비율, 그리고 primer의 길이이다.

위에서도 말했듯이 염기간의 결합은 G와 C는 세 군데에서 수소결합이 일어나고, A와 T는 두 군데에서 결합이 일어난다. 그러니까 primer의 길이가 길수록, 같은 길이라면 GC가 많을수록 primer와 template 사이에 형성되는 수소결합의 수가 많아진다. 따라서 template를 denature 시킨 후에 온도를 낮추어 annealing이 되는 온도 시점은 수소결합의 수가 많을수록 높아지게 된다. 그러므로 primer의 선정 시에 두 primer는 GC content와 length는 일치시키는 것이 좋다. 두 primer의 annealing temperature가 다르면 반응에 지장을 줄 수 있기 때문이다.

물론 아무리 일치시키려고 해도  안 되는 경우도 있지만 그런 경우를 제외하면 선정할 부분을 앞뒤로 움직여가면서 GC content가 50% 내외인 부분을 고르는 것이 가장 이상적인 Primer의 제작 범위이다.

Primer의 길이는 너무 길면 PCR 과정에서 Annealing하는데 시간이 많이 걸려 그 효율이 떨어지며 반대로 너무 짧으면 많은 수의 DNA 염기서열 중에서 원하는 유전자를 증폭해낼 수 있는 특이성이 떨어지므로 대개 17-25mer정도의 길이를 선택한다.

결론적으로 20mer(길이가 20 base)정도의 primer에 GC가 9개-11개 정도인 것을 찾으면 된다.

④ 이상한 염기서열은 피하라

primer 내부에서 annealing이 일어날 수 있는 염기서열도 피해야 한다. 예를 들어 F primer-GGCAATT .....  R primer-..........AATTGCC라는 primer는 primer끼리 붙을 수도 있기 때문에 그 서열이 서로 상보적인 부분이 있는지 확인해야 하고, 또 primer 내부에서 hairpin처럼 annealing 될 수도 있는 서열도 확인하여 그러한 부분의 염기서열은 Primer로 사용하지 않도록 한다.

 

3. dNTP(dATP, dCTP, dGTP, dTTP) : 유전자를 합성하는 재료가 되는 nucleotide들.

사용하는 양은 예상되는 PCR product size에 따라 다를 수 있으나 total 2.5mM정도 사용해서 0.2mM정도에서 반응이 일어나도록 한다. dNTP가 반응하는 동안 많이 존재하는 것보다 dNTP의 농도를 낮추는 쪽이 misprinting을 낮춰 PCR 특이성과 정확성을 높이게 된다.

 

4. Taq polymerase : 열에 특별히 강한 유전자 합성효소.

PCR에서 사용하는 polymerase는 Taq 1 polymerase로 이것은 Themus aquaticus로부터 정제한 효소이다. 이 생명체는 바다 밑의 뜨거운 곳에서 생존한다는 점에 근거하여 이 생물체 내의 enzyme이 열에 저항성을 지니고 있음을 발견하게 되었다. 보통의 enzyme들은 94℃까지 온도가 올라가게 되면 enzyme으로서의 기능을 상실하지만 Taq 1 polymerase는 그 기능을 유지하고 있기 때문에 PCR에서 이 polymerase를 사용할 수 있는 것이다. 그러나 일반적인 eukaryote의 DNA polymerase의 경우 mismatch된 염기서열을 바로잡을 수 있는 proof-reading 기능을 가지나 Taq 1 polymerase의 경우에는 그 기능을 가지고 있지 않기 때문에 mismatch의 error rate가 높다.

 

5. PCR buffer: PCR이 효율적으로 일어나도록 최적의 환경을 제공

-Mg2+의 농도-일반적으로 PCR반응에서는 1.5-2.5mM의 Mg2+의 농도가 필요하게 된다. Mg2+의 농도는 PCR을 실행할 때 다음의 사항에 관여하고 있는 것으로 여겨진다. ①효소의 활성 ②Pirmer의 annealing ③합성된 product의 정확성 ④template 및 PCR 산물의 변성온도 ⑤dNTP와의 결합

-BSA(bovime serum albumin)를 제공하여 Taq polymerase의 효소활성을 안정화시킨다.

-DMSO(Dimethyl Sulfoxide)를 제공하여 PCR reaction의 비특이적 결합을 줄인다..

이 같이 Taq polymerase의 효소활성을 촉진시키고 비특이적 결합을 막는 여러 물질들을 buffer로 제공하여 PCR이 효율적으로 일어나도록 한다.